Kalibration und Validierung

Klassische Standardaddition
Eine in der Analytik etablierte Kalibrationsmethode für die quantitative Bestimmung von Stoffen ist die Standardaddition nach DIN 32633 – VERFAHREN DER STANDARDANALYTIK. Diese Methode ist ein übliches Verfahren in der Laboranalytik zur Kalibration von Reinsubstanzen in Stoffgemischen und wird normalerweise im ersten Schritt bei der Erstellung des Kalibrationsmodells angewendet. Bei der Standardaddition werden bekannte Mengen eines Stoffes in äquidistanten Schritten zu einer unbekannten Menge einer Probenmatrix zudotiert. Empfehlenswert für eine ausreichende Genauigkeit sind fünf oder mehr Proben, wobei eine davon die Nullprobe darstellt, also die Ausgangsprobe ohne den zudotierten Analyt. Die hergestellten Proben werden danach spektroskopisch vermessen. Allerdings ist die Standardaddition nicht immer dazu geeignet, mehrere Stoffe innerhalb einer komplexen Matrix unabhängig voneinander zu kalibrieren.

Vorgehensweise Multimodale Standardaddition und Kalibration
Für Mehrkomponentensysteme können abgewandelte Formen der klassischen Standardaddition eingesetzt werden. Im ersten Schritt wird versucht, unter Berücksichtigung der molekularen Struktur der Komponenten und den notwendigen Bestimmungsgrenzen die Wellenlängenbereiche für die spektrale Untersuchung einzugrenzen. Damit können Korrelationen auf Basis von wissenschaftlichen Grundlagen („first principles“) erzielt werden und nicht nur rein statistisch korrelative Beziehungen berechnet werden. Im zweiten Schritt werden mit unterschiedlichen optischen Aufbauten und Einstellungen die optimale Messtechnik (Signal zu Rauschverhältnis) entwickelt. Dies ist die Basis für eine robuste und kausale Bestimmung von z.B. bis zu zehn unterschiedlichen Einzelkomponenten in einem Stoffmengengemisch. Dann können mit Hilfe der multimodalen Standardaddition Kalibrationen erstellt werden und deren Linearität überprüft werden.

Falls Abweichungen durch Wechselwirkungen auftreten wird ein DoE mit einigen wenigen Faktoren durchgeführt um die Ursachen der Abweichungen auf molekularer Ebene zu erkennen und geeignete Gegenmaßnahmen ergreifen zu können. Anschließend werden die Spektren der Proben multivariat ausgewertet und auf die wesentlichen Informationen verdichtet. Dies geschieht routinemäßig mit Hilfe der multivariaten Standardmethoden wie z.B. der PCA (Principal Component Analysis). Wenn auch Zielgrößen in die Auswertung integriert werden sollen geschieht dies mit Hilfe der PLS (Partial Least Square). Die Güte der Modelle wird bewertet z.B. durch den Korrelationskoeffizient r bzw. das Bestimmtheitsmaß, r2 für die gemessenen und die vorhergesagten Werte, das das Verhältnis aus erklärter Streuung (predicted y) zur Gesamtstreuung (measured y) repräsentiert. Des Weiteren wird berechnete der RMSEC (Root Mean Square Error of Calibration), dem experimentellen Fehler, der aus der Summe aller Restvarianzen berechnet wird, der SE (Standard Error), der die Standardabweichung der Residuen darstellt und der Bias (Mittelwert der Residuen), dem systematischen Fehler, der bei einem guten Fit möglichst nahe Null sein sollte.

Ziel der Prozedur ist eine möglichst geringe Anzahl der latenten Variablen zu erhalten um damit die Robustheit der Methode zu garantieren. Ziel ist dabei immer, die Selektivität der Messung zu erhöhen und den Einfluss möglicher Interferenten zu minimieren.

Validierung
Im ersten Schritt werden mit unterschiedlichen Verfahren wie z.B. Cross-Validation die möglichen Fehler abgeschätzt. Durch eine Validierung der Modelle mit unabhängigen Versuchen kann dann im zweiten Schritt das Modell sehr gut überprüft werden.